檢測(cè)口蹄疫血清抗體的方法

   （一）口蹄疫正向間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（間接血凝試驗(yàn)）

    該試驗(yàn)是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和豬水泡病病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物（細(xì)胞毒）經(jīng)PEG濃縮，蔗糖密度梯度超離后純化的病毒抗原分別致敏戊二醛鞣酸處理的綿羊紅細(xì)胞，而制成的血凝抗原，用于快速檢測(cè)動(dòng)物血清中的口蹄疫和豬水泡病特異抗體水平。

 該法簡(jiǎn)易、快速、特異、直觀、是當(dāng)前測(cè)抗的實(shí)用方法。

1． 試驗(yàn)材料    V型96孔110^。醫(yī)用血凝滴定板 、玻璃板（與血凝板大小相同）、微量移液器（10~100微升）、塑料咀、微量振蕩器、1毫升/5毫升 刻度玻璃吸管、玻璃中試管（內(nèi)徑1.5毫米，長(zhǎng)度100毫米）、鋁質(zhì)試管架（40孔）、口蹄疫各型和豬水泡正向間接血凝診斷液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型陽(yáng)性血清、SVD陽(yáng)性血清、陰性血清、稀釋液。

 2．試驗(yàn)方法 根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康目煞譃橛糜阼b別診斷；用于監(jiān)測(cè)疫苗接種動(dòng)物的抗體水平的檢測(cè)方法。

1. 疫苗接種動(dòng)物抗體水平監(jiān)測(cè)方法

 接種何種疫苗就使用何種正向血凝診斷液。

    ①稀釋待檢血清  在血凝板上1~8孔各加稀釋液50微升，取待檢血清50微升加入第1孔，混勻后從中取出50微升加入第2孔，混勻后從中取出50微升加入第3孔……直至第8孔混勻后從該孔取出50微升 丟棄，保持每孔50微升的劑量。此時(shí)1~8孔的血清稀釋度依次為1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：64、1：128、1：256。

②稀釋陰性對(duì)照血清  取中試管1支加稀釋液1.5毫升，再加陰性血清0.1毫升，充分搖勻陰性血清的稀釋度即為1：16。

③稀釋陽(yáng)性對(duì)照血清  取中試管5支，第1管加稀釋液3.1毫升，第2~5管分別加稀釋液0.5毫升，取陽(yáng)性血清0.1毫升 加入第1管混勻后從中取出0.5毫升，加入第2管混勻后從中取出0.5毫升，加入第3管……直至第5管，此時(shí)各管陽(yáng)性血清的稀釋度低次為1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。 

   ④滴加對(duì)照孔  取1：16稀釋的陰性血清50微升加入血凝板的第10孔；取1：500稀釋的陽(yáng)性血清50微升加入第11孔；取稀釋液50微升加入第12孔。

    ⑤滴加正向血凝診斷液   取正向血凝診斷液充分搖勻（瓶底應(yīng)無(wú)血球沉淀），每孔各加25微升后立即置微量振蕩器上振蕩1分鐘，取下血凝板放在白紙上觀察每孔中的血球是否均勻（孔底應(yīng)無(wú)血球沉淀）。如仍有部分孔底出現(xiàn)血球沉積，應(yīng)繼續(xù)振蕩直至*混勻?yàn)橹埂?/span>

⑥靜置   將血凝板放在室溫下（15~30℃）靜置2h后判定檢測(cè)結(jié)果，若結(jié)果不清晰或來(lái)不及判定，也可放置第2天判定。

   ⑦判定標(biāo)準(zhǔn)   先觀察10~12孔（對(duì)照孔），第10孔為陰性血清對(duì)照，應(yīng)無(wú)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，紅細(xì)胞全部沉入孔底，形成小園點(diǎn)或僅有25%紅細(xì)胞有凝集（“+"的凝集）；第11孔為陽(yáng)性血清對(duì)照，應(yīng)出現(xiàn)“++"以上的凝集（50%以上的紅細(xì)胞發(fā)生凝集），證明該批正向診斷液的效價(jià)達(dá)到1：512為合格；第12孔為稀釋液對(duì)照，紅細(xì)胞也應(yīng)全部沉入孔底或只有“+"的凝集。

    在上述對(duì)照合格的前提下，觀察待檢血清各孔，以出現(xiàn)“++"凝集的待檢血清zui大稀釋度為其抗體效價(jià)。例如檢測(cè)接種口蹄疫O型滅活疫苗的豬群免疫水平時(shí)，某份血清1-7孔出現(xiàn)“++"或“++"以上（+++~#）凝集而第8孔僅有“+"凝集，判定該份血清中的O型抗體效價(jià)為1：128。

    經(jīng)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定，口蹄疫O型滅活疫苗的免疫豬群血清中O型抗體效價(jià)達(dá)到1：128及其以上時(shí)，豬群可耐受20個(gè)O型強(qiáng)毒發(fā)病量的人工感染。

   （2）用于鑒別診斷的正向間接血凝試驗(yàn)

①稀釋待檢血清  取中試管8支列于試管架上，第1管加稀釋液1.5毫升，第2~8管各加稀釋液0.5毫升，取待檢血清0.5毫升 加入第1管混勻后從中取出0.5毫升加入第2管……直至第8管，待檢血清的稀釋度依次為1:4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。

②稀釋陰性對(duì)照血清   取中試管1支加稀釋液1.5毫升，再加陰性血清0.1毫升 ,即成1：16。

    ③稀釋陽(yáng)性對(duì)照血清   取中試管5支，列于管架上，每管加稀釋液4.9毫升陽(yáng)血，依次用記號(hào)筆標(biāo)明O、A、C、Asia型和SVD陽(yáng)血，分別取這5種陽(yáng)性血清10微升加入相應(yīng)的試管中（注意每加一種陽(yáng)性血清，必須單獨(dú)使用一根吸管），蓋上橡膠塞充分搖勻，陽(yáng)性血清的稀釋度即成1：500。

    ④滴加待檢血清和對(duì)照血清  取第8管待檢血清加入血凝板上的1~5排第8孔，取7管血清加入1~5排的第7孔，取第6管血清加入1~5排的第6孔……直至第1孔，每孔 50微升。取陰性血清（1：16稀釋度）加入1~5排的第10孔，每孔50微升。取1：500稀釋的陽(yáng)性血清加入1~5排的第11孔，每孔50微升。取稀釋液加入1~5排的第12孔，每孔50微升。

⑤滴加正向間接血凝抗原（正向診斷液） 第1排1~8孔和10~12孔加O型血凝抗原，每孔25微升。第二排1~8孔和10~12孔加A型血凝抗原，每孔25微升。第三排1~8孔和10~12孔加C型血凝抗原，每孔25微升。第四排1~8孔和10~12孔加Asia-1型血凝抗原，每孔25微升。第五排1~8孔和10~12孔加SVD血凝抗原，每孔25微升。加畢抗原后立即將血凝板置于微量振蕩器上中速振蕩1分鐘，使抗體和抗原充分混勻，各孔不應(yīng)有紅細(xì)胞沉淀。

⑥靜置  從振蕩器上取下血凝板，放在試驗(yàn)臺(tái)上，蓋上玻板，室溫（15~30℃）靜置2小時(shí)，判定結(jié)果，若結(jié)果不清晰或來(lái)不及判定，也可放置第2天判定。

⑦判定標(biāo)準(zhǔn)  先仔細(xì)觀察每排的10~12孔，10孔為陰性血清對(duì)照，12孔為稀釋液對(duì)照，這2孔均應(yīng)無(wú)凝集現(xiàn)象，或僅出現(xiàn)“+"的凝集。11孔為口蹄疫4個(gè)型和豬水泡病1：500稀釋的陽(yáng)性血清對(duì)照，應(yīng)出現(xiàn)“++" ~ “+++"的凝集，證明所使用的5種血凝抗原試劑合格。

    在對(duì)照孔符合上述標(biāo)準(zhǔn)的前提下，觀察1~5排的第1~8孔，某排1~8孔，出現(xiàn)“#"~“++"的凝集，其余4排僅在1~3孔出現(xiàn)“++"~“+"的凝集，便可判定該份待檢血清為陽(yáng)性，其型別與所加的血凝抗原的型別相同。例出第1排的1~3孔出現(xiàn)“#"凝集，第4-5孔出現(xiàn)“+++"凝集，第6孔出現(xiàn)“++"凝集，第7孔出現(xiàn)“+"凝集，第8孔無(wú)凝集（“—"），判定該份待檢血清為口蹄疫O型，表明血清中存在O型抗體其效價(jià)為1：128。如果該份血清采自口蹄疫O型疫苗免疫過(guò)的動(dòng)物，就不能判定究竟是自然感染產(chǎn)生的抗體，還是接種過(guò)疫苗產(chǎn)生的抗體。因?yàn)楸痉ㄉ胁荒軈^(qū)分感染性抗體和免疫性抗體。為此，欲使本法用于鑒別診斷，采血時(shí)必須要弄清該批動(dòng)物是否接種過(guò)口蹄疫或豬水泡病疫苗。

    ⑧注意事項(xiàng)

A．嚴(yán)重溶血和污染的血清樣品不宜檢測(cè)，以免產(chǎn)生非特異反應(yīng)。

B．勿用90^o和130^o血凝板，以免誤判。

     C．有時(shí)會(huì)出現(xiàn)“前帶"現(xiàn)象，即第1~2孔紅細(xì)胞沉淀而在第3~4孔又出現(xiàn)凝集，這是由于抗原抗體比例失調(diào)所致，不影響結(jié)果的判定。

D．血清必須是來(lái)自康復(fù)動(dòng)物，至少是發(fā)病后10天的血清，否則不易檢出。

     注：稀釋液配方如下：

      Na₂HPO4·12H₂O  (磷酸氫二鈉)      35.8克

      Na₂H₂PO4·2H₂O  （磷酸二氫鈉)      1.56克

      NaCl           （氯  化  鈉）      8.5克

      NaN₃           （迭  氮  鈉）      1.0克

    加雙蒸水或去離子水至1 000毫升，15磅高壓滅菌20分鐘，冷卻后取出980毫升加正常兔血清20毫升即成，置4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩Ｔ撆浞竭m用于正向間接血凝試驗(yàn)和反向被動(dòng)血凝試驗(yàn)，也適用于豬瘟間接血凝試驗(yàn)。

正向間接血凝抗原及其配套試劑由中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫綜防研究組提供。

   （二）口蹄疫中和試驗(yàn)

病毒或毒素與相應(yīng)抗體結(jié)合后，能使其失去對(duì)易感動(dòng)物的致病力或?qū)?xì)胞的感染力，稱為中和試驗(yàn)，中和試驗(yàn)不僅可在易感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行，亦可在細(xì)胞培養(yǎng)或雞胚中進(jìn)行。

1．細(xì)胞中和試驗(yàn)

一般采用固定病毒稀釋血清法，該法須在無(wú)菌條件下操作，亦須細(xì)胞適應(yīng)毒。

   （1）取兩列無(wú)菌試管，*列為正常血清對(duì)照組，第二列為待檢血清中和組。先在二列試管中的第1管加含有0.5%水解乳蛋白的漢克氏液（乳白液）3毫升；第2~6管各加乳白液2毫升。

   （2）取正常血清1毫升加入*列的第1管，取待檢血清1毫升加入第二列的第1管，混勻后，以同法對(duì)倍稀釋，1~6管的正常和待檢血清稀釋度依次為1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128。

   （3）二列試管中的1~6管分別加入 200TCID₅₀細(xì)胞適應(yīng)毒2毫升 充分搖勻，置37℃水浴中保溫60分鐘。

   （4）取各稀釋度的血清分別接種3瓶長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞，傾去舊的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液，每瓶接種1毫升，置37℃恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)3天，每日鏡檢一次并詳細(xì)記錄細(xì)胞病變情況。

   （5）細(xì)胞培養(yǎng)3天后判定結(jié)果，正常血清對(duì)照組的細(xì)胞應(yīng)全部出現(xiàn)病變；中和組的血清1：8以上無(wú)細(xì)胞病變，判為陽(yáng)性。1：8的血清出現(xiàn)細(xì)胞病變則判為陰性，該法特異性強(qiáng)，結(jié)果可靠，但要求無(wú)菌設(shè)備和培養(yǎng)細(xì)胞的條件，操作繁瑣，基層難以應(yīng)用。

2．乳鼠中和試驗(yàn)

5~7日齡小白鼠對(duì)人工接種口蹄疫病毒易感染，產(chǎn)生特征性癥狀和規(guī)律性死亡。因此利用這一特性進(jìn)行乳鼠中和試驗(yàn)。操作步驟如下：

（1） 將待檢血清用生理鹽水或pH7.6的0.1M PBS稀釋成1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，分別與等量的10^-3口蹄疫乳鼠適應(yīng)毒混合，37℃水浴保溫60分鐘。

（2） 每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陰性血清（1：8）與10^-3病毒的混合液作為病毒對(duì)照；已知陽(yáng)性血清與10^-3病毒的混合液作為陽(yáng)性對(duì)照，處理方法同（1）步驟。

（3） 每一稀釋度血清中和組分別于頸背皮下接種5~7日齡乳鼠4只，對(duì)照組接種2只，0.2毫升/只，由母鼠哺乳，觀察5天判定結(jié)果。

    （4）判定標(biāo)準(zhǔn)  先檢查對(duì)照鼠，陰性對(duì)照鼠應(yīng)于48小時(shí)內(nèi)病死；陽(yáng)性對(duì)照鼠應(yīng)健活。待檢血清任何一組的乳鼠健活或僅死二只，判定該份血清為陽(yáng)性。以能保護(hù)50%接種乳鼠免遭病毒感染的血清zui大稀釋度為乳鼠中和效價(jià)。

    該法特異性強(qiáng)，結(jié)果可靠，簡(jiǎn)單易行，基層可采用。但存在需時(shí)較長(zhǎng)，乳鼠易被母鼠所吃或咬死，敏感性低等缺點(diǎn)。

（三）口蹄疫乳鼠保護(hù)試驗(yàn)

    待檢血清稀釋成1：5，接種乳鼠后12小時(shí)或24小時(shí)，用10^-3病毒攻毒，同時(shí)設(shè)陰性血清和已知陽(yáng)性血清（均為1：5稀釋）作為對(duì)照。觀察5天后判定結(jié)果。在陰性和陽(yáng)性血清對(duì)照成立的前提下，待檢血清組的乳鼠健活，判定該份血清為陽(yáng)性，反之，則判為陰性。

該法多用于定性檢測(cè)，一般不作為定量檢測(cè)手段。

（四）口蹄疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

抗原抗體在瓊脂凝膠中，各以其固有的擴(kuò)散系數(shù)擴(kuò)散，當(dāng)二者相遇時(shí)，在比例適當(dāng)處發(fā)生結(jié)合而形成肉眼可見(jiàn)的沉淀帶。

操作步驟如下：

1．稱取瓊脂糖或瓊膠素1 克 ,迭氮鈉1克，氯化鈉 0.85克加pH7.6的0.01M PBS 100毫升。置沸水中煮熔化或15磅高壓10分鐘。趁熱傾入平皿中，厚度3~4毫米。

2. 瓊脂冷卻凝固后，用打孔器打成中央一孔周圍6孔的梅花形孔；中央孔徑4~5毫米，周圍孔徑3毫米與中央孔的孔距3~4毫米。

3.中央孔加已知型別的濃縮抗原，四周孔加不同稀釋度的待檢血清和陰性、陽(yáng)性對(duì)照血清（1：2稀釋），靜置擴(kuò)散1小時(shí)。

4. 移入濕盒內(nèi)于室溫或在37℃溫箱內(nèi)自由擴(kuò)散3~5天，也可放置于4~6℃冰箱內(nèi)擴(kuò)散。

5. 判定標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)沉淀線判陽(yáng)性，反之，則判為陰性。

該法無(wú)需特殊儀器，設(shè)備通常用于定性檢測(cè)，但需時(shí)間長(zhǎng)，敏感性差，漏檢率高。

   （五）口蹄疫微量補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

    1．在U型24孔或96孔微量滴定板上每孔滴入生理鹽水100微升。

    2．每孔滴入一份經(jīng)過(guò)56℃滅活30分鐘的待檢血清25微升。

  3．每板設(shè)已知陰性、陽(yáng)性血清2孔對(duì)照（與待檢血清試驗(yàn)條件相同）。

  4．每孔滴入口蹄疫標(biāo)準(zhǔn)抗原25微升。

  5．每孔滴入補(bǔ)體工作濃度50微升。振蕩30秒，37℃溫箱保溫40分鐘。

  6.每孔加溶血素工作濃度 25微升和2%綿羊紅細(xì)胞 25微升，振蕩30秒于37℃下保溫30分鐘。

    判定結(jié)果，陰性對(duì)照血清孔應(yīng)*溶血；陽(yáng)性血清對(duì)照孔應(yīng)不溶血為合格。凡*溶血的待檢血清判為陰性；凡不溶血的待檢血清判為陽(yáng)性。

 該法特異性強(qiáng)，但敏感性低，適用于定性檢測(cè)。 

（六）口蹄疫對(duì)流免疫電泳

1. 電泳槽內(nèi)的緩沖液為巴氏妥——巴氏妥鈉緩沖液。

2. 1克 瓊脂糖加pH7.6的0.1M PBS 100毫升加熱熔解后澆灌在5×13厘米玻板上厚度為0.6~0.8毫米，冷卻凝固后用打孔器制成二排孔，其距離為3~4毫米，每5對(duì)孔為一組，組間距離為10毫米。

3. 每組左邊孔，分別加O、A、C、Asua-1型和SVD濃縮抗原，每組右邊孔加1：2的待檢血清。每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陰性、陽(yáng)性血清對(duì)照，抗原孔邊用濕濾紙搭橋接陰極；血清孔邊用濕濾紙搭橋接陽(yáng)極。電壓為80-110V，電流強(qiáng)度為15mA，電泳90分鐘后取出凝膠板，并置于濕盒內(nèi)37℃放置3~4小時(shí)判定結(jié)果。

4. 先檢查對(duì)照孔，陰性血清應(yīng)無(wú)沉淀線；陽(yáng)性血清應(yīng)出現(xiàn)清晰的沉淀線。凡與標(biāo)準(zhǔn)抗原對(duì)應(yīng)孔的中間形成沉淀線的待檢血清判為陽(yáng)性，其型別與標(biāo)準(zhǔn)抗原的型別相同，反之，則判為陰性。

該法較瓊擴(kuò)靈敏度高，適用于大批血清樣品的檢測(cè)。