Nthy-ori 3-1|Nthy-ori 3-1細(xì)胞 培養(yǎng)

對于貼壁細(xì)胞，若細(xì)胞漂?。号囵B(yǎng)瓶不開封，用75%酒精擦拭后平躺置于培養(yǎng)箱內(nèi)。次日觀察，如細(xì)胞大部分又貼回瓶底，表明細(xì)胞活力正常，剩余漂浮的細(xì)胞可以去掉，換成新鮮的培養(yǎng)基；如細(xì)胞還不貼壁，將細(xì)胞離心收集移到新的培養(yǎng)瓶中，原培養(yǎng)瓶加部分新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，中間注意觀察，我們的技術(shù)人員會一直跟蹤指導(dǎo)，直到問題解決。對于懸浮細(xì)胞：收到細(xì)胞后，將細(xì)胞全部離心，去掉舊的培養(yǎng)基，換成新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

特別注意：（如使用公共實(shí)驗(yàn)室或者初次接觸，建議添加雙抗培養(yǎng)）

（1）貼壁細(xì)胞收到當(dāng)天有少量或沒有飄忽的細(xì)胞可以當(dāng)天換液，因?yàn)槁吠绢嶔ぴ斐纱罅匡h忽的情況時(shí)，請將細(xì)胞換液后放置培養(yǎng)箱孵育到第二天再做消化傳代，請優(yōu)先選擇直徑6cm的培養(yǎng)皿進(jìn)行傳代培養(yǎng)

（2）收到細(xì)胞后請盡快更換為含10%血清的新鮮培養(yǎng)基，如因特殊情況需要繼續(xù)使用原瓶，請?jiān)谠颗囵B(yǎng)基中額外添加10%的血清，（原瓶培養(yǎng)基的繼續(xù)使用時(shí)間zui長不宜超過72小時(shí)）

（3）如簽收時(shí)出現(xiàn)培養(yǎng)瓶壁破裂，漏液等情況請及時(shí)做好照片記錄并SUER技術(shù)人員

細(xì)胞接收后的操作流程與注意事項(xiàng)：

1）貼壁細(xì)胞生長緩慢；適當(dāng)提高血清濃度（zui高不能超過20%），或可根據(jù)該細(xì)胞生長特性生長密度，考慮胰酶消化后，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)

2）如果細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，而收到時(shí)呈懸浮或者部分懸浮的狀態(tài)，請將懸浮的細(xì)胞即時(shí)離心，加15%血清的*培養(yǎng)基到新的培養(yǎng)皿/瓶繼續(xù)培養(yǎng)3天；同時(shí)原培養(yǎng)瓶中剩下的貼壁細(xì)胞更換為15%血清的*培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。3天后若原瓶或者新瓶中的細(xì)胞都沒有出現(xiàn)增值而是繼續(xù)脫落死亡，請及時(shí)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員會跟進(jìn)解決

3）生長不均：貼壁細(xì)胞若出現(xiàn)分布不均，成島狀生長，可將細(xì)胞進(jìn)行消化，重懸打散細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)

細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)傳代流程（請嚴(yán)格遵照無菌操作）

（1）吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS緩沖液潤洗細(xì)胞兩次，加2-3ml 0.25%胰酶進(jìn)行消化細(xì)胞（注意把握消化時(shí)間，通?？刂圃?-2min）

（2）注意培養(yǎng)基PH值變化情況，定期換液（每周2-3次），待細(xì)胞密度達(dá)到80%以后重復(fù)1項(xiàng)操作或者凍存

（3）取部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿/瓶中，添加適當(dāng)?shù)?培養(yǎng)基，把細(xì)胞懸液打勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

（4）鏡下觀察消化情況，在HS505.T人淋巴結(jié)成纖維樣細(xì)胞生長特性邊緣縮小，貼壁松動(dòng)時(shí)（不建議消化到細(xì)胞漂浮）去掉胰酶，加6-8ml*培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞層，盡量把細(xì)胞層吹落，吹散。

請各位老師以隨貨說明為主

MTT點(diǎn)板時(shí)一定要將細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，而且一定要混勻，用排槍，否則，MTT的SD會狂大！

2、點(diǎn)板布局

其實(shí)這一點(diǎn)很多人不懈一顧。如果你的細(xì)胞要養(yǎng)48 h或更長，建議不要吝嗇96-孔板的四周邊孔，這32個(gè)邊孔不能使用，建議加入滅菌PBS以飽和中間64個(gè)孔的水分。因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)過程中，邊孔的水分蒸發(fā)很快，培養(yǎng)液及里面的藥物會出現(xiàn)濃縮現(xiàn)象，細(xì)胞的狀況就復(fù)雜了，有些人稱之為%26ldquo;邊緣效應(yīng)%26rdquo;這些孔的SD也會狂大，既然如此，不如不用。

3、加MTT

如果確認(rèn)你考察的藥物沒有氧化還原性，你可以直接加入MTT溶液（總體積的1/10），如果你沒有把握，建議在加MTT前換一次液；如果你肯定考察的藥物的氧化還原性很強(qiáng)，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建議你用PBS將細(xì)胞洗洗，否則這些藥物會將MTT還原成棕褐色沉淀，這種效果可能是你不需要的。

4、加入MTT后的反應(yīng)

時(shí)間為3-4h，此時(shí)棄去各孔中的液體在加入200微升的DMSO。為了將沉淀溶解*，盡可能將水棄除干凈，加入DMSO后在搖床上震搖10min。提醒：如果你的細(xì)胞貼壁不好，此時(shí)的沉淀在棄去液體時(shí)易丟失，因此貼壁不好的細(xì)胞在點(diǎn)板時(shí)記得將96孔板用多聚賴氨酸處理處理，要么在棄液體時(shí)先用甩板機(jī)離心，再輕輕棄去液體。關(guān)于DMSO的量，每孔的體積有點(diǎn)兒差異不干擾檢測，只要能將沉淀*溶解就行了。至于DMSO的體積差異不同為什么不影響檢測值已經(jīng)被數(shù)學(xué)證明了，在此我不多說，如果有人不明白我再證明給他看。當(dāng)然為了養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣，DMSO的體積還是一致的好。

5、檢測MTT

還原的MTT在460-630均有較好的吸收，如果你的酶標(biāo)儀是濾光片，可以選470 nm左右或630 nm左右的濾光片，如果酶標(biāo)儀有單波長，你可以在檢測前掃描一下吸收譜，選用zui大細(xì)說波長檢測就是了，zui大波長，大概在550nm附近，必要時(shí)加一個(gè)參比波長以扣除非特異性吸收。

6、吸收值分析

在理想的MTT實(shí)驗(yàn)中，如果是細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)，不加藥物處理組的吸收值應(yīng)該在0.8-1.2左右，太小檢測誤差占的比例較多，太大吸收值可能已經(jīng)超出線性范圍。這個(gè)原理在朗伯-比爾定律中有解釋。

7、建議

如果你覺得MTT中出現(xiàn)的問題不好解決，那么建議你做CCK-8實(shí)驗(yàn)，原理與MTT相似，但操作上簡化些，當(dāng)然，費(fèi)用也稍微高一些。

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