VMRC-RCW細胞，傳代細胞培養(yǎng)

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VMRC-RCW細胞，傳代細胞培養(yǎng)[實驗步驟1]

1、準備工作：1）肥皂洗手，在進行無菌操作前，用75% 的酒精擦拭雙手，注意指間，和指甲周圍。同時，用酒精棉球擦拭超凈臺。2）將培養(yǎng)液放置室溫，備用。3）打開超凈臺內的紫外燈，照射20 min。同時，將實驗所需材料也放入超凈臺進行滅菌（血清、培養(yǎng)基除外）4）倒置顯微鏡下，觀察細胞的狀態(tài)，是否已經長滿培養(yǎng)瓶，需要進行分瓶。

2、關閉超凈臺的紫外燈，打開風機。

3、點燃酒精燈，取出刻度吸管，在火焰上略燒，然后，安上吸球待用。

4、在打開培養(yǎng)瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶蓋，打開后，瓶口在酒精燈上過火焰，再用吸管輕輕吸出舊的培養(yǎng)液，注意，吸管不要碰到布滿細胞的培養(yǎng)瓶的側壁。

5、將胰酶加入培養(yǎng)瓶內,顯微鏡下隨時觀察，見到細胞的突起消失，變圓時，立即翻轉培養(yǎng)瓶，吸出胰酶。記住不要消化時間過長，否則，細胞會被胰酶消化掉。

6、加入適量Hanks液或培養(yǎng)基清洗一遍，立即倒掉。

7、加入含有10%血清的培養(yǎng)基，用吹打管吹打，一定要輕輕吹打，使其從瓶壁上脫落分散到培養(yǎng)基中，再補加培養(yǎng)基，按1:3進行分瓶。然后，用火焰燒培養(yǎng)瓶的瓶口和蓋，再蓋好培養(yǎng)瓶的蓋，放到培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

以上介紹的是貼壁細胞的傳代培養(yǎng)方法，對于懸浮細胞的傳代培養(yǎng)方法，只需要將細胞進行離心，1000 rpm，5 min,然后，換入新的培養(yǎng)基即可。再分裝到不同的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。

不健康的細胞質中有空泡，細胞內有顆粒樣物質，細胞間空隙增大，變形，不規(guī)則，失去原有的特點。

4. 是否污染：

傳代或換液24~ 48 h注意觀察細胞是否被污染，污染的細胞培養(yǎng)液變渾濁，鏡下可見有大量菌絲。如果細胞生長緩慢，生長特性改變，胞質內顆粒性物質增多，盡管培養(yǎng)液不變渾濁，考慮可能有支原體污染。污染的細胞立即從培養(yǎng)箱中取走，以免污染其它細胞。

實驗四、細胞凍存與復蘇

VMRC-RCW細胞，傳代細胞培養(yǎng)[實驗步驟2]

1. 為了保證細胞良好的狀態(tài)，在細胞凍存的前一天使細胞處于對數(shù)增長期，同時將細胞換液，次日，按照細胞傳代培養(yǎng)方法，用胰酶消化貼壁細胞，將細胞用培養(yǎng)基沖下來，然后，用50 mL尖底離心管離心，1000 rpm，4min，棄上清，收集細胞。

2. 加入適量的凍存液（10% DMSO 和 90%含有20%血清的IMDM培養(yǎng)基）

3. 分裝到凍存管中，做好標記，標明細胞名稱，保存時間，所用培養(yǎng)基等。

4. 4℃放置30 min；-20℃放置1.5 h； -70℃放置12 h；zui后移到液氮罐中。

細胞的復蘇：

細胞的復蘇原則是快速溶化，因為如果緩慢的溶化，會使進入細胞的水分形成冰晶，對細胞造成傷害，因此，在復蘇細胞時，將凍存細胞直接放到37℃的水浴中，使其迅速溶解。在超凈臺內將凍存管內的細胞懸浮液直接倒入小培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內，然后，加入3 mL的培養(yǎng)液。次日，觀察細胞生長情況，并更換細胞培養(yǎng)液。

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